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临床试验中免疫指标检测方法

时间: 2021-11-17 13:22 来源: 免疫密码

T细胞在体内持久性

临床试验中检测T细胞在体内存活时间的方法主要有反转录PCR法TCR基因扫描、 MHC-肽四聚体染色法、实时荧光定量PCR和流式细胞分析技术。

同一克降T细胞重排后其互补决定区3(CDR3)的长度和序列完全相同,而不同克隆T细胞有所不同,因此分析TCR CDR3的长度和序列,可以作为判别t细胞克降性的指标,通过分析TCRVβ亚家族的分布及克隆特点,可对特定克隆亚群细胞进行分析;T细胞通过特异性TCR识别由MHC分子提呈的抗原肽,因此可用荧光标记的MHC-肽复合物检测抗原特异性T细胞。Altman等首次发明此方法并应用于检测可识别HIV抗原肽的特异性CTL,获得成功。该方法具有迅速、直接、灵敏且特异性强的优点,比传统 CTL有限稀释法敏感性高10100倍;实时荧光定量pCr是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,基于引物和探针的靶向和放大CAR-T或TCR-T的编码DNA,通过与阳性对照组DNA相比较,可定量检测基因转染的t细胞;流式细胞分析技术(flow cytometiy)是借助流式细胞仪对细胞进行快速准确的鉴定和分类的技术,利用偶联不同荧光抗体标记不同的细胞表面分子,再依据不同的细胞表面分子区分细胞亚群,或者通过分析细胞表面或细胞内蛋白的表达情况,评价细胞功能。

早期临床试验,主要利用反转录PCR法TCR基因扫描技术检测TIL克隆或选择抗原特异性T细胞。目前,MHC-肽四聚体染色法被越来越多用于检测表达特定抗原表位的T细胞,抗原可以是高表达抗原、分化抗原、肿瘤-睾丸抗原和新抗原。一旦确定了T细胞的抗原表达信息,就可以利用反转录PCR法TCR基因扫描技术或MHC-肽四聚体染色技术分析回输的T细胞在体内的增殖和存活时间。

在CAR-T和TCR-T临床试验中,主要利用实时荧光定量PCR和流式细胞分析技术定性和定量分析T细胞。大多数CAR-T临床试验利用荧光定量PCR技术检测T细胞在外周血、肿瘤组织或骨髓中的存在情况。利用流式细胞术检测的优点在于可同时检测T细胞的多个参数,如可同时检测CAR-T细胞上其他如分化、激活或耗竭相关表面分子的表达情况流式细胞仪和荧光定量PCR在检测外周血中的CAR-T时具有同样的敏感性。荧光定量PCR和流式细胞分析技术同样用于TCR-T临床试验中相关免疫治疗指标的检测。

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