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抗肿瘤单克降抗体制备策略

时间: 2021-11-17 13:26 来源: 免疫密码

19世纪末,人们发现使用相应抗原免疫动物后,获得含有多克隆抗体的动物抗血清可以用于治疗早期的肺炎、白喉、麻疹等传染病,从而开启了抗体在医学中的治疗时代。1975年杂交瘤技术的问世,使抗体技术发展进入单克隆抗体的新时代,但鼠源单克隆抗体会产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)反应,限制了其在临床上的应用。20世纪70年代,日本医学家利根川进在基因水平探讨了抗体的多样性形成机制,证实了Ig基因结构,获得1987年诺贝尔生理学或医学奖。之后,随着分子生物学技术的发展,人们开始对抗体进行改造,先后出现了嵌合抗体和人源化抗体,很大程度上解决了鼠抗HAMA反应的问题。20世纪90年代以后,随着PCR技术、抗体库技术和转基因技术的发展,治疗性单抗得以实现全人源化改造,目前在临床上,尤其是在肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病的治疗方面得以广泛应用。本节将主要探讨抗肿瘤单克隆抗体的开发和制备策略。

基于动物免疫的抗体制备策略

杂交瘤抗体技术

1975年德国医学家Kohler和英国医学家Milstein开展了一项具有划时代意义的新技术,他们首次在体外通过将绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合,成功获得了杂交瘤细胞,经过筛选扩大培养后这种杂交瘤细胞可以产生只针对某一特定的抗原决定簇的抗体,称为单克隆抗体。这种通过将能无限大量繁殖的肿瘤细胞与能产生抗体的 B细胞融合,以产生既能无限增殖又能产生特异性抗体的技术称为杂交瘤技术。

杂交瘤技术的主要流程可以概括为:①将免疫动物的脾细胞和无限增殖的瘤细胞融合以得到杂交瘤细胞;②以分泌目标抗体为限制条件,筛选得到的杂交瘤细胞:③扩大培养分泌目标抗体的杂交瘤细胞,使之单克隆化;④运用体外培养或体内诱导法,分离提纯以获得大量的目标单克隆抗体(图6-1)。

传统的杂交瘤技术具有生产成本较低、可持续性生产、操作性较好等优点,目前仍然是制备单克隆抗体的主要方法之一。通过杂交瘤技术产生的单克降抗体具有纯度高、效价高、特异性好的特点,广泛应用于生物医药、临床诊断和治疗中。但杂交瘤技术也存在一些问题:①是否有合适的骨髄瘤细胞系决定能否有目标克隆抗体产生;②融合形成的杂交瘤细胞也可能低产导致难以分离培养;③因基因不稳定性导致一些难以预料的问题:④因鼠源性抗体的免疫原性,产生HAMA反应,导致机体免疫损伤⑤不能有效激活补体系统且在体内的半衰期较短而起不到良好的免疫效应作用。

人源化抗体

由于单克隆抗体大多数是鼠源性的,在人体内可诱导产生人抗鼠抗体,产生HAMA 反应,限制单克隆抗体在临床中的应用。随着基因工程技术的发展及对各类抗体结构、功能和编码基因认识的深入,可通过将异源抗体中与抗原结合的相关氨基酸结构与人抗体相互组合拼接构成经人源化改造的抗体,以减轻异源性抗体的免疫副作用。

目前对Ig分子结构已经有较清楚的认识,Ig分子的基本结构是一“Y”字形的四肽链结构,由两条相同的重链(heavy chain, H)和两条相同的轻链(light chain, L)借助二硫键连接起来。其中在多肽链的N端,占轻链的1/2,重链的1/4的氨基酸序列随抗体的不同而有所变化,称为可变区(variable region,VR),重链和轻链的V区分别称为VH 和VL,各有三个氨基酸排列顺序高度可变的区域,称为高变区(hypervariable region, HVR), 高变区是抗原与抗体特异性结合的位点,其与抗原表位在空间结构上互补,又称为互补决定簇(complementarity determining region,CDR)。可变区中的四个非髙变区部位氣基酸 排列较为固定,形成骨架结构夹持着CDR,故称为骨架区(frame work region, FR)。恒 定区(constant region,CR)在多肽链的C端,占轻链的1/2,重链的3/4,其氨基酸数量、 种类、排列顺序均较稳定,不同Ig分子的CH长度不一,可以为CH1-3或CH1-4。

对于鼠源性的单克隆抗体的人源化改造研究过程可以分为2个主要的发展阶段: ①将鼠源性单克隆抗体的VR和人源性抗体的CR相互组合,形成嵌合抗体:②仅仅保留鼠源性单克隆抗体VR中与抗原结合的CDR,而将FR、CR均改为人源抗体的组成结构, 制备形成的抗体称为CDR移植抗体或称改型抗体(图6-2)。

嵌合抗体

嵌合抗体合成的基本原理为:通过利用DNA重组技术,将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中,转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体,这样表达的抗体分子中轻重链的V 区是异源的,而C 区是人源的,整个抗体分的近2/3部分都 是人源的。通过这样的技术合成的抗体,减少了异源性抗体的免疫原性,同时保留了亲抗体特异性结合抗原的能力。目前嵌合抗体主一有三种应用形式:嵌合IgG抗体、嵌合Fab抗体、嵌合F(ab')2抗体。嵌合IgG抗体含有人抗体的Fc段能有效的介导细胞免疫治疗以及激活补体系统,但鼠源性成分较多,免疫原性大且不易穿透组织,后两种抗体分子量小、穿透力强,但因不具有人抗体的Fc段而不能直接通过细胞毒作用发挥生物活性,可作为小分子药物载体或用于诊断试验。

改型抗体

改型抗体又称CDR移植抗体,是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体的全部构成均由人类抗体基因所编码而产生的抗体,可以明显减少异源抗体因其免疫原性对人类机体造成的免疫副作用。抗体可变区的CDR直接决定抗体的特异性,是抗体识别和结合抗原的区域。用鼠源性单抗的CDR移植到人源性抗体的可变区替换人源性抗体CDR, 使人源性抗体获得鼠源性单抗的抗原结合特异性,合成的重组抗体称为改型抗体,可分为完全CDR移植抗体、部分CDR移植抗体、特异决定区移植抗体三种类型。完全CDR移 植抗体是指将鼠源性单抗的CDR区完全移植到人源性抗体中形成的移植抗体;部分CDR 移植抗体是指由于并不是所有CDR均为抗原抗体特异性结合所必需的,将抗原抗体结合所必需的CDR移植到人源性抗体上以实现减小免疫原性的抗体;特异决定区移植抗体是指将一个CDR中参与抗原识别的特异蛋白分子构成的特异决定区移植替换人源性抗体中相应区域后形成的抗体,其免疫原性有很大程度的降低。然而,虽然抗原与抗体的特异性结合主要与CDR相关,夹持着CDR的支架结构骨架区也可以通过影响CDR的空间构型 来发挥.定的作用,因此重组抗体中鼠源CDR和人源骨架区相嵌的结构可能会导致抗原原有CDR构型的改变,从而导致结合抗原的能力下降。

全人抗体

全人抗体是目前治疗性抗体的主要开发趋势,目前生产全人抗体的技术已达到比较成熟的阶段,主耍包括抗体库技术和基因工程小鼠技术。具体而言,全人抗体是指通过噬菌体展示库技术、核糖体展示库技术等抗体库技术,或者通过将编码人类抗体的全部基因通过转基因或转染色体技术转移至经过基因工程改造的抗体基因缺失的动物中而表达出人类抗体,来达到抗体全人源化的目的。全人抗体可大幅度地消除异源抗体或部分人源化抗体的免疫原性,避免通过激的免疫副作用,增加抗体应用的安全性,目前已应用于诊断、检测和临床治疗当中,但也面临着一些问题,如制备工艺要求较高、不同单抗经过人源化以后悔出现不同程度的与抗原结合能力的下降,一般而言人源化抗体的结合力为原本的33%~50%,在长期、大量、重复应用人源化单抗时,仍然可能会出现HAMA反应。

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