江川纪念 SETA 研究室新世代细胞
免疫治疗研究室

对肝细胞癌的治疗方法包括手术疗法、肝动脉栓塞术（TAE）、射频消融（RFA）等局部疗法，以及使用细胞毒性药物的化学疗法。肝癌治疗中最大的问题在于，即使早期发现局部根治后复发率仍然很高，单病灶切除术后的3年复发率高达72%。临床报告显示TAE术后实施RFA的临床试验中，1、3、5年的无复发率分别为64.5%、40.1%、18.0%。报告中治疗方法TAE中包括使用化学药物的TACE治疗。经过TAE后RFA的病例中，长期仍保持高复发率，从而复发时仍需要同样的治疗，反复治疗后的病例都显示了长期预后恶化的倾向。

肝动脉栓塞术（TAE）是用导管经动脉接近病变处，注入血管栓塞物质来治疗的方法。在狭义上讲是对肿瘤“段军粮”的方法。在广义上讲是通过栓塞物质调整血流走向，提高局部病灶的药物分布以加强疗效的方法。
为了进一步提高该疗法的疗效本临床试验用DDS（Drug & Dendritic cell Delivery System）将抗癌药物、树突状细胞缓慢释放到治疗目标，以促进临床研究。

本试验基于肿瘤免疫循环的基础，以下说明。经局部治疗（RFA）后癌细胞陷入程序死亡状态，激活抗原提示细胞即树突状细胞（dendritic cells）并使之成熟，DC游走至淋巴结内，在此处开始诱导激活T细胞。被激活的T细胞通过血管浸润到肿瘤组织内，开始攻击癌细胞。我们设想向进入程序死亡的癌组织追加注射树突状细胞后，可能会诱发更强烈的抗肿瘤免疫反应。期待单一细胞可以组织肝癌的复发。

多项临床研究的结果汇总。左侧图表显示的是副作用，与没有投放树突状细胞的TAE比较，投放各种树突状细胞引起发热，发热的持续时间却没有延长，没有发生NCI-CTC3级以上有害事件。右侧图表显示的是无复发生存率，与TAE比较，投放了OK432刺激的树突状细胞的明显抑制了复发。说明使用OK432刺激的树突状细胞激活了肿瘤免疫应答，抑制了肝细胞癌的复发。该临床研究的成果显示，TAE治疗的癌细胞程序死亡可作为肿瘤免疫循环的起动剂，再投放的树突状细胞加速了免疫反应，从结果上抑制了肿瘤细胞的增殖。

下面，我们比较了TAE+RFA治疗和TAE+RFA+OK432治疗的案例。治疗组合对照组病例中，在临床因素、慢性肝病的发展程度、肿瘤病期、肿瘤数量、最大肿瘤直径、AFP数据上没有有效差异。

我们论证了树突状细胞治疗抑制肝细胞癌复发的作用机理。图表上部分显示使用ELISPOT测量CD8+T细胞对癌抗原肽的反应程度。使用OK432刺激树突状细胞治疗后，诱导了部分抗原的反应。从DTH皮内反应观察，CD4+T细胞被诱导。图表下部分显示了使用BioPlex测量的主要细胞因子、驱动因子的观察结果。

我们观察到IL-９、IL-15、TNF-α、Eotaxin、MIP-1β等Ⅰ型辅助T细胞的细胞因子与树突状细胞的有无反应是不同的。也就是说，在没有投放树突状细胞时（白色）细胞因子反应不良，投放OK432树突状细胞（红色）后细胞因子开始增加。相对Ⅰ型，与Ⅱ型辅助T细胞相关的IL-4、IL-10因子在投放前后没有变化。此外，接受治疗后，骨髓由来的抗肿瘤免疫细胞（MDSC）活性有下降倾向。从这些结果推断，OK432诱导了Ⅰ型辅助T细胞的免疫反应，同时也减轻了免疫抑制压力，发挥了抗肿瘤效果。
以上的研究结果显示，从末梢血液诱导培养的树突状细胞投入肝癌的局部治疗方法，能够增强T细胞介入的全身性肿瘤免疫治疗效果，可以作为抑制肿瘤复发的治疗方法。

常用的免疫细胞疗法中，很难增殖免疫功能低下患者的淋巴细胞（LAK），不容易培养足够的数量。而且癌细胞本身具备的免疫逃逸机制使投放LAK效果不佳，也是个临床运用的难题。在此背景下，我们期待利用组织工程学的方法嵌合抗原受体，改变基因的T细胞疗法能够解决这些问题。

①构造
在CAR的基本构造中，由1）识别抗体中的靶点，特异性结合部位（scFv）；2）细胞膜贯通部位；3）细胞活化部位（CD３ζ锁链）3个部分构成了嵌合蛋白（第1代）。为了增加T细胞的活性，现在已经有了第2代、第3代的改良，CD28、41BB。

※1 嵌合蛋白：基因转换技术可结合不同蛋白

②CAR的特点
改变CAR的标的结合部位（scFv），可以产生针对各种靶点的具有特异性和攻击性的效应T细胞（CTL）。此外，只利用抗体标的进行识别，不用考虑癌细胞的MHC识别路径，与通常使用的必须通过MHC识别的CTL相比，没有MHC表达的癌细胞也可以被识别。也就是说，CAR的识别能力比通常免疫细胞治疗的CTL的特异性更优越，可以期待更高的免疫聚集性（发现标的开始攻击的结合能力）。

③CAR-T细胞疗法
从患者末梢采集血液中的单核细胞，在抗CD3抗体和IL-2环境中培养后，对激活了的T细胞使用病毒载体，导入CAR基因（DNA）。导入基因后，再培养数日。
※２ 抗CD3抗体和IL-2是激活、增殖T细胞的必须因子。

【国外(美国)】
针对白血病和淋巴瘤使用CD19特异的CAR疗法，针对神经母细胞瘤使用GD2特异的CAR疗法，临床试验进展最迅速，有部分文献报告了明显的治疗效果。

利用CAR-T细胞治疗的问题，主要有以下3点。
① 期待较高的治疗效果的同时，具有容易诱发严重的自体免疫疾病（细胞因子释放综合征等）的风险（有死亡案例）。
② 可作为CAR的标的抗原种类多，但是细胞内的抗原，很难被CAR识别。
③ CAR的标的抗原，因癌种而不同，需要分别鉴别癌种（患者）的个体特异性scFv（识别标的的部位）

滉志会与大阪大学一起，正在研究开发制作针对“血管内皮增殖因子受体VEGFR2的CAR识别CTL（CAR-T）。

【特点】
用EP法将flk１特异的结合部位（scFv）+细胞膜贯通部位+细胞活化担当部位（CD28及CD3ζ）CAR（第2代）的mRNA导入T细胞。
※3 EP法：电刺激细胞后细胞短时间内开口，从开口处将mRNA、蛋白质等导入细胞的技术。

人类免疫系统不仅仅清除入侵机体的细菌和毒素，也是肿瘤能机体内发生疾病时的自然防御系统。这个系统也称为“肿瘤免疫循环”（Chen and Mallman, 2013)⁽¹⁾。目前的研究表明，人类免疫细胞是按照以下过程清除体内癌细胞的。

1. 发现癌细胞的树突状细胞贪食变异了的抗原，并识别它。
2. 树突状细胞向T细胞递程已经识别了的抗原，诱导效应性T细胞（CTL）的活性。
3. 激活的CTL浸润到肿瘤微环境。
4. CTL识别肿瘤细胞后与其结合。
5. 结合了癌细胞的CTL释放细胞伤害物质（穿孔素、分解酶等），导致癌细胞凋亡（程序化死亡）。
6. 凋亡的癌细胞释放出变异抗原和相关抗原（TAA）。这些被释放的抗原再被树突状细胞识别，开始下一次免疫循环（1~6），周而复始激活免疫。

在肿瘤免疫虚幻中，增强并活化CTL的免疫细胞疗法，与解除阻碍该免疫循环的免疫检查点抑制剂联合使用，可期待治疗效果。

近年来，在肿瘤治疗领域免疫细胞疗法和免疫检查点抑制剂得到关注，细胞毒性T细胞（CTL）的激活和免疫抑制因子的控制都是必要的。一方面，免疫检查点抑制剂解除免疫抑制后间接诱导免疫应答，其他药物治疗无效的患者用该药有效，但是受众率有限。比如Opdivo治疗非小细胞肺癌受益者只有2成^(3)(4)(5)。为了得到更好的免疫应答，有必要考虑在免疫增强和抑制解除方面同时着手。我们一方面期待这种联合免疫疗法能为患者带来福祉，但是其安全性至今没有得到充分的评估和验证。因此，治疗开始前为希望治疗的患者提供特定的标志物预判，治疗开始后尽早能评测治疗效果，以及确定治疗时间都需要由切实可行的指标来明确，虽然目前有很多研究正在这方面努力，但是仍然没有找到明确的标志物。关于Opdivo的安全性，一方面没有化疗的副作用强烈，另一方面却有严重的副作用出现，使用Opdivo时，必须有紧急情况的应对方案，以及完整的管理体系⁽⁶⁾。实际上，已经有过使用免疫检查点抑制剂后再使用免疫细胞治疗的死亡案例，虽然没有证据显示他们有明确的相关性，但是日本劳动厚生省已经发文（平县成28年7月28日）要求医疗机构引起重视，慎用联合疗法。
在这样的背景下，为了确立安全且更有效的治疗方法，实现普及，本研究将科学地评估免疫细胞疗法联合免疫检查点抑制剂为患者带来的好处，在肿瘤治疗方面，这非常重要。